Le président tchèque Vaclav Klaus a signé le traité de Lisbonne le 3 novembre 2009, quelques heures après que la Cour constitutionnelle tchèque avait jugé le traité conforme à la loi fondamentale du pays. Vaclav Klaus était le dernier des dirigeants des 27 Etats membres de l'Union européenne à ne pas avoir encore signé ce document. Il avait différé sa signature en demandant une dérogation à la Charte des droits fondamentaux, figurant en annexe au traité. Cette dérogation, finalement obtenue le 30 octobre 2009 à l'issue du Conseil européen à Bruxelles, devrait empêcher, selon Vaclav Klaus, toute restitution des biens des Allemands des Sudètes confisqués après la Seconde guerre mondiale.

Selon les textes officiels, "l'entrée en vigueur du traité est prévue le premier jour du mois suivant le dépôt à Rome des instruments de ratification de l'Etat signataire qui procède en dernier à cette formalité", soit le 1er décembre 2009.

Les dirigeants européens vont devoir choisir, à l'occasion d'un sommet extraordinaire, le premier président du Conseil européen, ainsi que le haut représentant pour les affaires étrangères et la politique de sécurité de l'Union européenne qui sera également vice-président de la Commission européenne.

Les gouvernements des pays membres devraient également rapidement donner les noms de leur commissaire afin que José Manuel Barroso complète la composition de la Commission européenne. L'actuelle Commission est arrivée en fin de mandat le 31 octobre 2009 et expédie actuellement les affaires courantes.